植物組織原位雜交的步驟包括以下幾個方面:
1. 制備組織樣品:從植物中取出需要研究的組織樣品,如根、莖、葉等。
2. 固定組織樣品:將組織樣品固定在載玻片上,通常使用或乙醇等化學物質(zhì)進行固定。
3. 處理組織樣品:對固定的組織樣品進行脫水、透明化、脫脂等處理,以便于DNA探針的穿透和結(jié)合。
4. 制備DNA探針:根據(jù)需要研究的基因序列,設計并合成DNA探針。DNA探針可以標記熒光染料或性同位素,以便于檢測。
5. 雜交DNA探針:將DNA探針與組織樣品進行雜交,通常需要在高溫下進行,以便于DNA探針與RNA或DNA結(jié)合。
6. 檢測雜交信號:通過熒光顯微鏡或計數(shù)器等設備,檢測DNA探針與RNA或DNA的結(jié)合情況,確定目標基因的表達模式和位置。
原位雜交雜交液
(一)雜交液內(nèi)除含一定濃度的標記探針外,還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛白蛋白及載體DNA或RNA等。
(二)雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加,可以減低探針與組織標本之間的靜電結(jié)合。
(三)賈酰胺可使雜交溫度降低,所以雜交液中加入適量的甲酰胺,可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞以及標本的脫落。
(四)硫酸葡聚糖能與水結(jié)合,從而減少雜交液的有效容積,提高探針有效濃度,以達到提高雜交率的目的。
熒光原位雜交(FISH)技術(shù)具有以下優(yōu)點:
可多重染色:利用不同的熒光染料標記不同的探針,可以實現(xiàn)多重熒光原位雜交,染色體原位雜交,從而同時檢測多個序列,提高實驗效率了。
高度創(chuàng)新性和性:FISH技術(shù)不僅可以用于研究已知基因或序列的染色體定位,還可以用于未基因或遺傳標記及染色體畸變的研究,在基因定性、定量、整合、表達等方面的研究中頗具優(yōu)勢。
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